fa اندازه گیری همزمان 25- هیدروکسی کوله کلسیفرول و 25-هیدروکسی ارگوکلسیفرول به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا سایر تخصص هاي باليني Other Clinical Specialties پژوهشي Original <p align="justify"> <strong>مقدمه و هدف</strong>: با توجه به شیوع بالای درجات مختلف کمبود ویتامین D در ایران، ارزیابی صحیح وضعیت این ویتامین برای مقاصد بالینی، پژوهشی و بهداشتی اهمیت به سزایی دارد. غلظت سرمی 25-هیدروکسی D ) D(OH) (25، به عنوان نماگر معتبر وضعیت ویتامین D پذیرفته شده است. سنجشهای مبتنی بر کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، روشهای استاندارد اندازه گیری 25(OH)D به شمار می آیند. هدف از انجام این مطالعه راه اندازی یک روش معتبر و نسبتاً ساده مبتنی بر HPLC برای اندازه گیری غلظت سرمی 25(OH)D با به کار گیری آشکارساز فرابنفش بود. </p><p align="justify"> <strong>روش کار</strong>: پروتئینهای سرم با استفاده از اتانل و سپس آمیزۀ متانل: ایزوپروپانل (90:10، حجمی) رسوب داده و سپس 25-هیدروکسی کلسیفرول به کمک فاز آلی هگزان، استخراج شد. هگزان تحت گاز ازت تبخیر و رسوب حاصله در متانل حل شد و پس از فیلتراسیون، نهایتاً μL 20 از محلول صاف شده به ستون Teknochroma tracer excel 150´4, 3μm تزریق و کروماتوگرافی با فاز متحرک متانل: آب (85:15، حجمی) حاوی 0.01 درصد BHT و دمای ستون °C 40 انجام شد. این روش قادر به شناسایی افتراقی D3(OH)25 و D2(OH)25 در طول موج nm 265 بود. نتایج حاصل از آزمایش 90 نمونۀ سرم انسانی با این روش، با نتایج دو روش رایج پرتو-ایمنی سنجی (RIA) و واکنش رقابتی پیوند به پروتئین (CPBA) مقایسه گردید. درجۀ همخوانی نتایج این سه روش با استفاده از تعیین ضریب همبستگی و آنالیز بلند-آلتمن ارزیابی شد. </p><p align="justify"> <strong>نتایج</strong>: زمان بازداری برای D3(OH)25 و D2(OH)25 به ترتیب 9.5 و 10.7 دقیقه به دست آمد. منحنی های استاندارد برای D3 (OH) 25 تا غلظت nmol/L 375 و برای D2(OH) 25 تا غلظت nmol/L 187.5 خطی بود. حد آشکار سازی برای هر دو ویتامر L/nmol 12.5 بود. درصد بازیافت برای D3(OH)25 و D2(OH)25 در آزمایش های متعدد به ترتیب 5.6 ± 101% و 5.4 ± 100.8% به دست آمد. تغییرات درون و میان سنجشی برای D3(OH)25 به ترتیب 8.1% و 12.6% بود. دو روش RIA و CPBA نتایج بالاتری نسبت به HPLC به دست دادند (0.02=p). روش RIA در مقایسه با CPBA همخوانی بیشتری را با HPLC نشان داد. </p><p align="justify"> <strong>نتیجه‌نهایی</strong>: روش HPLC معرفی شده در این مطالعه برای اندازه گیری سطوح سرمی 25(OH)D، روشی است قابل اعتماد و نسبتاً سریع با این مزیت که توانایی شناسایی افتراقی 25(OH)D2 و 25(OH)D3 را نیز دارد. </p> <p align="justify"> <strong>Introduction & Objective</strong>: High prevalence of vitamin D insufficiency in Iran calls for a reliable assessment of vitamin D status for diagnostic, research as well as public health purposes. Circulating level of 25(OH)D has been generally accepted as a reliable indicator of vitamin D status. HPLC-based analyses are considered as standard methods for 25(OH)D assays. The aim of this study was to set up a precise, reliable and rather simple HPLC-based method to determine serum levels of 25(OH)D using ultra violet detector. </p><p align="justify"> <strong>Materials & Methods</strong>: Serum proteins were precipitated using ethanol and then methanol: iso-propanol (90:10, v/v). 25(OH)D was then extracted using hexane, which was then evaporated under nitrogen flow. The sediment reconstituted in methanol was further filtered. Finally, 20μL of the filtrate was injected to the column, teknochroma tracer excel 150×4, 3 μm. Chromatography was run with the mobile phase of methanol:water (85:15, v/v) containing 0.01% BHT at the column temperature 40°C. The vitamers 25(OH)D3 and 25(OH)D2 were detected at 265nm. For further evaluation of the method, 90 human serum samples were analyzed for 25(OH)D using HPLC, competitive protein binding assay (CPBA) and radioimmunoassay (RIA). The degree of agreement between those three methods was evaluated using coefficient of correlation and Bland-Altman analysis. </p><p align="justify"> <strong>Results</strong>: Retention times of 25(OH)D3 and 25(OH)D2 were 9.5 and 10.7 min, respectively. Standard curves of both vitamers showed linearity up to 375 nmol/L (D3) and 187.5 nmol/L (D2). Recovery percents for 25(OH)D3 and 25(OH)D2 were found 101±5% and 100.8±5.4%, respectively. Intra- and inter-assay variations for 25(OH)D3 were 8.1% and 12.6%, respectively. The results of RIA and CPBA were significantly higher than those of HPLC (p=0.02). RIA, compared to CPBA, showed more agreement with HPLC. </p><p align="justify"> <strong>Conclusion</strong>: The new HPLC method for serum 25(OH)D determination is reliable and rather fast with the advantage of detecting both 25(OH)D2 and 25(OH)D3. </p> پرتوایمنی سنجی , سنجش رقابتی پیوند به پروتئین , کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا , ویتامین د Competitive Protein Binding Assay , High Performance Liquid Chromatography , Radioimmunoassay , Vitamin D 5 10 http://sjh.umsha.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-2-330&slc_lang=fa&sid=1 Tirang Neyestani تیرنگ نیستانی tneyestani@nnftri.ac.ir 10031947532846001403 10031947532846001403 Yes Azam Gharavi اعظم غروی 10031947532846001404 10031947532846001404 No Ali Kalaie علی کلایی 10031947532846001405 10031947532846001405 No Mohammad Samadi محمد صمدی 10031947532846001406 10031947532846001406 No