Avicenna Journal of Clinical Medicine
مجله پزشكي باليني ابن سينا
Avicenna J Clin Med
Medical Sciences
http://sjh.umsha.ac.ir
1
admin
2588-722X
2588-7238
-
10.52547/ajcm
-
-
-
fa
jalali
1382
6
1
gregorian
2003
9
1
10
2
online
1
fulltext
fa
تعیین نیمه کمی میزان بیان mRNA اینترفرون گاما با استفاده از روش RT-PCR
In Vitro Semi-Quantitative Determination of Human Gamma-Interferon-mRNA Level by RT-PCR
سایر تخصص هاي باليني
Other Clinical Specialties
پژوهشي
Original
<p dir="rtl" style="margin: 0cm -0.05pt 0pt 0cm; text-align: justify;"><span id="ctl00_ContentPlaceHolder1_DataList1_ctl00_abstractLabel" style="font: 12px/15pt tahoma; color: rgb(45, 135, 179); text-transform: none; text-indent: 0px; letter-spacing: normal; word-spacing: 0px; white-space: normal; widows: 1; font-size-adjust: none; font-stretch: normal; background-color: rgb(247, 246, 243); -webkit-text-stroke-width: 0px;"><span style="font-size: 11pt;">سایتوکاینها واسطه های شیمیائی هستند که از سلولهای سیستم ایمنی ترشح شده، و بر سلولهای دیگر یا خود سلول ترشح کننده اثر می کنند. بیان متفاوت ژن سایتوکاینها در بدن مشخص کننده نوع پاسخ ایمنی (از نوع </span><font size="2"><span dir="ltr">Th1</span></font><span style="font-size: 11pt;"> یا </span><font size="2"><span dir="ltr">Th2</span></font><span style="font-size: 11pt;">) است که خود این پاسخ متفاوت می تواند نقش مهمی در پاتوژنز بیماریها داشته باشد. از عمده ترین سایتوکاینهای سلولهای </span><font size="2"><span dir="ltr">Th1</span></font><span style="font-size: 11pt;"> می توان به </span><font size="2"><span dir="ltr">IFN-</span><span dir="ltr">γ</span></font><span style="font-size: 11pt;"> و </span><font size="2"><span dir="ltr">IL-2</span></font><span style="font-size: 11pt;"> اشاره کرد. که در پاسخهای ایمنی علیه پاتوژنهای داخل سلولی شرکت می کنند. با توجه به اینکه بیان ژن سایتوکاینها منجمله اینترفرون موقتی بوده و در یک مدت زمان محدود می باشد ، به این علت لازم است بیان ژن آنها (مقدار </span><font size="2"><span dir="ltr">mRNA</span></font><span style="font-size: 11pt;">) توسط روشهای حساس و دقیقتری همانند </span><font size="2"><span dir="ltr">RT-PCR</span></font><span style="font-size: 11pt;">اندازه گیری شود .بعلاوه تعیین زمان مورد نیاز جهت ماگزیمم بیان ژن می تواند در مطالعات کلونینگ و استعداد ابتلا به بیماریها در بعضی ازافراد کاربرد داشته باشد.</span></span></p>
<p dir="rtl" style="text-align: justify;"><span id="ctl00_ContentPlaceHolder1_DataList1_ctl00_abstractLabel" style="font: 12px/15pt tahoma; color: rgb(45, 135, 179); text-transform: none; text-indent: 0px; letter-spacing: normal; word-spacing: 0px; white-space: normal; widows: 1; font-size-adjust: none; font-stretch: normal; background-color: rgb(247, 246, 243); -webkit-text-stroke-width: 0px;"><span style="font-size: 11pt;"> بعد از کشت لنفوسیتها در حضور </span><font size="2"><span dir="ltr">PHA</span></font><span style="font-size: 11pt;"> (</span><font size="2"><span dir="ltr">Phytohaemagglutinin</span></font><span style="font-size: 11pt;">) ( با غلظت </span><span dir="ltr"><font size="2">1</font></span><font size="2"><span dir="ltr">μg/10</span><sup><span dir="ltr">6</span></sup><span dir="ltr">cell</span></font><span style="font-size: 11pt;"> ) در زمانهای متفاوت (72،0،4،8،12،24،48 ساعت) و استخراج </span><font size="2"><span dir="ltr">RNA</span></font><span style="font-size: 11pt;"> توتال از آنها و سنتز </span><font size="2"><span dir="ltr">cDNA</span></font><span style="font-size: 11pt;"> تک رشته ای اقدام به انجام </span><font size="2"><span dir="ltr">RT-PCR</span></font><span style="font-size: 11pt;"> شد. چون در تمام ساعات انکوبه جواب مثبت بود لذا در مرحله بعدی اقدام به تیتراسیون </span><span dir="ltr"><font size="2">cDNA</font></span><span style="font-size: 11pt;">حاصل با ضریب رقت 1.2 (رقتهای متوالی 1.2، 1.4، 1.8،و</span><span dir="ltr"><font size="2">…</font></span><span style="font-size: 11pt;">.) شد. بر روی ژل الکترفورز (2%) قطعه مورد نظر (</span><span dir="ltr"><font size="2">273bp </font></span><span style="font-size: 11pt;">) مشاهده شد.</span></span></p>
<p dir="rtl" style="text-align: justify;"><span id="ctl00_ContentPlaceHolder1_DataList1_ctl00_abstractLabel" style="font: 12px/15pt tahoma; color: rgb(45, 135, 179); text-transform: none; text-indent: 0px; letter-spacing: normal; word-spacing: 0px; white-space: normal; widows: 1; font-size-adjust: none; font-stretch: normal; background-color: rgb(247, 246, 243); -webkit-text-stroke-width: 0px;"><span style="font-size: 11pt;"> نتایج بدست آمده از </span><font size="2"><span dir="ltr">RT-PCR</span></font><span style="font-size: 11pt;"> و </span><font size="2"><span dir="ltr">Semi-quantitative-RT-PCR</span></font><span style="font-size: 11pt;"> نشان می دهد بعد از چهار ساعت انکوباسیون لنفوسیتها با </span><font size="2"><span dir="ltr">PHA</span></font><span style="font-size: 11pt;"> ، بیشترین بیان ژن را دارند (تیتر </span><font size="2"><span dir="ltr">cDNA=512</span></font><span style="font-size: 11pt;">) و معمولاً بعد از گذشت 24 ساعت مقدار آن به سطح اولیه (قبل از تحریک) بر می گردد.</span></span></p>
<p><span id="ctl00_ContentPlaceHolder1_DataList1_ctl00_abstractLabel" style="font: 12px/15pt tahoma; color: rgb(45, 135, 179); text-transform: none; text-indent: 0px; letter-spacing: normal; word-spacing: 0px; white-space: normal; widows: 1; font-size-adjust: none; font-stretch: normal; background-color: rgb(247, 246, 243); -webkit-text-stroke-width: 0px;"><span dir="rtl" style="font-size: 11pt;"> با توجه به نتایج فوق و مقایسه آن با نتایج محققین دیگر می توان گفت روش <span dir="ltr"><font size="2">RT-PCR</font> </span> حساسترین روش سنجش بیان ژن جهت سایتوکاینهاست و بیان ژن اینترفرون بعد از گذشت چهار ساعت انکوبه به ماکزیمم می رسد. بنابر این مدت زمان انکوباسیون با PHA جهت بررسی اثر عوامل مختلف بر تولید و بیان ژن اینتر فرون گاما زمان ایده آلی است.</span></span></p>
<p style="font: 16px/normal "Times New Roman"; text-align: justify; color: rgb(45, 135, 179); text-transform: none; text-indent: 0px; letter-spacing: normal; word-spacing: 0px; white-space: normal; widows: 1; font-size-adjust: none; font-stretch: normal; background-color: rgb(247, 246, 243); -webkit-text-stroke-width: 0px;"><span style="font-size: 12pt;">Cells communicate with one another not only by cell-cell contact, but also via the elaboration of soluble mediators or cytokines. The functionally distinct repertoire of secreted cytokines of Th1/Th2 cells has been shown to play an important role in the pathogenesis of inflammatory diseases. Effector Th1 cells secretes predominantly IFN-</span><span style="font-size: 12pt;"> γ</span><span style="font-size: 12pt;"> and IL-2 and regulates cell-mediated immunity against intracellular pathogens. Regulatory cytokines<br>
are likely to be secreted in small quantities in response to specific stimuli and taken by responder cells. As a result, many scientists determine cytokine’s m-RNA expression by using a more sensitive technique, RT-PCR.</span></p>
<p style="font: 16px/normal "Times New Roman"; text-align: justify; color: rgb(45, 135, 179); text-transform: none; text-indent: 0px; letter-spacing: normal; word-spacing: 0px; white-space: normal; widows: 1; font-size-adjust: none; font-stretch: normal; background-color: rgb(247, 246, 243); -webkit-text-stroke-width: 0px;"><span style="font-size: 12pt;"> The expression of IFN-</span><span style="font-size: 12pt;"> γ</span><span style="font-size: 12pt;"> -mRNA was studied using semiquantitative RT- PCR. Lymphocytes were stimulated by phytohaemagglutinin (PHA) (1</span><span style="font-size: 12pt;">μ</span><span style="font-size: 12pt;">g/10<sup>6</sup>) in culture medium (incubation time: 0,4,8,12,24,48 and72 hour) and total RNA extracted and cDNA synthesized. IFN-</span><span style="font-size: 12pt;"> γ</span><span style="font-size: 12pt;"> was detected by the<br>
RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) and semi-quantitative-RT-PCR methods, in which sequences (273bp) between two oligonucleotide primers (chosen from two exons of the IFN-</span><span style="font-size: 12pt;"> γ</span><span style="font-size: 12pt;">gene sequences) were amplified using a heat-stable DNA polymerase. In semi-quantitative RT-PCR we used a serial dilution (1/2,1/4…) of cDNA in order to determine the titer of cDNA for that will give visible band in 2% agarose gel electrophoresis.</span></p>
<p style="font: 16px/normal "Times New Roman"; text-align: justify; color: rgb(45, 135, 179); text-transform: none; text-indent: 0px; letter-spacing: normal; word-spacing: 0px; white-space: normal; widows: 1; font-size-adjust: none; font-stretch: normal; background-color: rgb(247, 246, 243); -webkit-text-stroke-width: 0px;"><span style="font-size: 12pt;"> Results showed that after 4h incubation express highest level of IFN-</span><span style="font-size: 12pt;"> γ</span><span style="font-size: 12pt;">- mRNA and it is stable until 24 hour after that. Then it falls to baseline level.</span></p>
<p style="font: 16px/22.66px "Times New Roman"; text-align: justify; color: rgb(45, 135, 179); text-transform: none; text-indent: 0px; letter-spacing: normal; word-spacing: 0px; white-space: normal; widows: 1; font-size-adjust: none; font-stretch: normal; background-color: rgb(247, 246, 243); -webkit-text-stroke-width: 0px;"><span style="font-size: 12pt;"> In order to study the IFN-</span><span style="font-size: 12pt;"> γ</span><span style="font-size: 12pt;"> gene expression kinetic compare results with other studies show that RT-PCR detection of IFN-</span><span style="font-size: 12pt;"> γ level is more sensitive than </span><span style="font-size: 12pt;">other methods like Elisa and for maximum expression of</span><span style="font-size: 12pt;"> IFN-</span><span style="font-size: 12pt;"> γ gene 4h </span><span style="font-size: 12pt;">incubation</span><span style="font-size: 12pt;"> of lymphocytes with PHA</span><span style="font-size: 12pt;"> is sufficient.</span></p>
اینترفرون گاما , لنفوسیتهای فعال شده با PHA , واکنش زنجیره پلیمراز
IFN- ? , PHA Activated Lymphocytes , Semi-Quantitative-RT-PCR , Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
5
11
http://sjh.umsha.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-2-586&slc_lang=fa&sid=1
Jalil
Tavakol Afshari
جلیل
توکل افشاری
10031947532846002540
10031947532846002540
No
Alireza
Zamani
علیرضا
زمانی
10031947532846002541
10031947532846002541
Yes
Javad
Behravan
جواد
بهروان
10031947532846002542
10031947532846002542
No
Behrouz
Shisheeyan
بهروز
شیشه ئیان
10031947532846002543
10031947532846002543
No
Bita
Saifi
بیتا
سیفی
10031947532846002544
10031947532846002544
No